小鼠膀胱平滑肌细胞的培养操作及其应用！
小杨 / 2024-04-30 08:54:50
一、背景
小鼠膀胱平滑肌细胞采用酶解法制备而来，α-SMA、Desmin呈阳性，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
膀胱壁由三层组织组成，由内外为粘膜层、肌层和外膜。其中，肌层由平滑肌构成。体外培养膀胱平滑肌细胞不仅为组织工程膀胱，尿道提供种植细胞的必要手段，也是研究平滑肌瘤的基础与前提。
膀胱是由平滑肌细胞组成的中空器官。膀胱平滑肌的舒张和收缩使得膀胱分别储存和排出尿液。膀胱平滑肌细胞表型的调控和可诱导一氧化氮合酶的表达与多种病理状况有关，包括膀胱功能障碍。研究表明，组织缺氧抑制人类膀胱平滑肌细胞的增殖，膀胱平滑肌细胞的分化依赖于膀胱上皮细胞释放的因子。膀胱平滑肌细胞外基质的分泌表型可通过细胞所经历的机械变形频率而改变。平滑肌是许多疾病中的共同路径，因此，了解在疾病发生及持续过程中平滑肌怎样变化，这是治疗方法取得进展的重要一步。
二、培养操作
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
三、应用
用于SGK1/NFAT2和IL-1β在膀胱出口梗阻中促进膀胱平滑肌细胞增殖及焦亡的研究：
构建了慢性膀胱出口梗阻模型及急性膀胱出口梗阻模型,以研究急性梗阻和慢性梗阻之间膀胱的不同病理变化。结合应力-细胞增殖模型去揭示膀胱出口梗阻过程中疾病进展的机制。
方法：将雌性BALB/c小鼠分成3组:对照组（n=9）,逐渐梗阻组（n=9）和直接梗阻组（n=9）。使用逐渐缩窄尿道外口和直接缩窄尿道外口的方法分别来构建慢性和急性梗阻模型。在构建急性梗阻后1,2和4周,检测膀胱的病理生理改变。同时对小鼠膀胱平滑肌细胞（MBSMC）进行不同的循环静水压力的施加,然后检测细胞增殖,炎症的表达水平以及细胞周期。
用Si RNA干扰敲除
小鼠膀胱平滑肌细胞中的SGK1表达,然后检测NFAT2的表达。结果:与慢性膀胱出口梗阻模型相比,急性膀胱出口梗阻模型在膀胱出口梗阻早期导致膀胱出现更强的增殖、炎症和纤维化。低水平的应力刺激可促进小鼠膀胱平滑肌细胞增殖,过大的应力刺激会抑制细胞增殖且增加小鼠膀胱平滑肌细胞死亡的比例。
使用SGKI si RNA干扰实验敲除SGKI后NFAT2的表达明显下调。结论:急性膀胱出口梗阻导致膀胱功能更快失代偿。慢性膀胱出口梗阻比急性膀胱出口梗阻具有更强的适应能力是一种更加合适的疾病研究模型。
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